A fluoreszcens szűrő a fluoreszcencia mikroszkóp alapvető eleme. Egy tipikus rendszernek három alapvető szűrője van: egy gerjesztőszűrő, egy emissziós szűrő és egy dikroikus tükör. Általában egy kockába csomagolják, így a csoportot együtt helyezik be a mikroszkópba.
Hogyan működik a fluoreszcens szűrő?
Gerjesztő szűrő
A gerjesztő szűrők meghatározott hullámhosszú fényt sugároznak át, és más hullámhosszakat blokkolnak. Különböző színek előállítására használhatók, ha a szűrőt úgy hangolják, hogy csak egy színt engedjenek át. A gerjesztő szűrőknek két fő típusa van – hosszú áteresztő szűrők és sávszűrők. A gerjesztő általában egy sáváteresztő szűrő, amely csak a fluorofor által elnyelt hullámhosszakat engedi át, így minimálisra csökkenti más fluoreszcenciaforrások gerjesztését, és blokkolja a gerjesztő fényt a fluoreszcencia emissziós sávban. Ahogy az ábrán a kék vonal is mutatja, a BP 460-495, ami azt jelenti, hogy csak a 460-495 nm-es fluoreszcencián tud áthaladni.
A fluoreszcens mikroszkóp megvilágítási pályáján belül van elhelyezve, és kiszűri a fényforrás összes hullámhosszát, kivéve a fluorofor gerjesztési tartományt. A szűrő minimális átvitele határozza meg a képek fényerejét és ragyogását. Minden gerjesztőszűrő esetében legalább 40%-os átvitel javasolt, hogy az átvitel ideális esetben >85%. A gerjesztőszűrő sávszélességének teljes mértékben a fluorofor gerjesztési tartományán belül kell lennie úgy, hogy a szűrő középső hullámhossza (CWL) a lehető legközelebb legyen a fluorofor gerjesztési hullámhosszának csúcsához. A gerjesztőszűrő optikai sűrűsége (OD) határozza meg a háttérkép sötétségét; Az OD annak mértéke, hogy egy szűrő mennyire blokkolja az átviteli tartományon vagy sávszélességen kívüli hullámhosszokat. A minimális OD 3,0 ajánlott, de a 6,0 vagy nagyobb OD az ideális.
Emissziós szűrő
Az emissziós szűrők azt a célt szolgálják, hogy a mintából a kívánt fluoreszcencia elérje a detektort. Blokkolja a rövidebb hullámhosszakat, és nagy áteresztőképességgel rendelkezik a hosszabb hullámhosszokhoz. A szűrőtípushoz egy szám is tartozik, pl. az ábrán BA510IF (interferencia barrier szűrő), ez a jelölés a maximális átvitel 50%-ánál lévő hullámhosszra vonatkozik.
Ugyanezek a gerjesztőszűrőkre vonatkozó ajánlások érvényesek az emissziós szűrőkre is: minimális átvitel, sávszélesség, OD és CWL. Az ideális CWL, minimális átvitel és OD kombinációjú emissziós szűrő a lehető legfényesebb képeket, a lehető legmélyebb blokkolással biztosítja, és biztosítja a leghalványabb emissziós jelek észlelését.
Dichroic Mirror
A dikroikus tükör a gerjesztő szűrő és az emissziós szűrő közé van elhelyezve 45°-os szögben, és visszaveri a gerjesztő jelet a fluorofor felé, miközben az emissziós jelet a detektor felé továbbítja. Az ideális dikroikus szűrők és sugárosztók éles átmenetekkel rendelkeznek a maximális reflexió és a maximális áteresztőképesség között, a gerjesztőszűrő sávszélességének visszaverődése >95%, az emissziós szűrő sávszélessége pedig >90%. Válassza ki a szűrőt a fluorofor metszésponti hullámhosszának (λ) szem előtt tartásával, hogy minimalizálja a szórt fényt és maximalizálja a fluoreszkáló kép jel-zaj arányát.
Ezen az ábrán a dikroikus tükör a DM505, ezért nevezték el, mert 505 nanométer a hullámhossz a maximális átvitel 50%-ánál. Ennek a tükörnek az áteresztési görbéje 505 nm feletti nagy áteresztőképességet, 505 nanométertől balra meredek átviteli csökkenést és 505 nanométertől balra a maximális visszaverődést mutat, de 505 nm alatt is előfordulhat némi áteresztőképesség.
Mi a különbség a hosszú áteresztő és a sávszűrő között?
A fluoreszcens szűrők két típusra oszthatók: hosszú áteresztő (LP) és sáváteresztő (BP).
A hosszú áteresztő szűrők hosszú hullámhosszakat sugároznak, és blokkolják a rövidebbeket. A vágási hullámhossz a csúcsátvitel 50%-ánál érvényes érték, és a vágási határ feletti összes hullámhosszt a hosszú áteresztő szűrők továbbítják. Gyakran használják dikroikus tükrökben és emissziós szűrőkben. Longpass szűrőket kell használni, ha az alkalmazás maximális emissziós gyűjtést igényel, és ha a spektrális megkülönböztetés nem kívánatos vagy szükséges, ami általában azokra a szondákra vonatkozik, amelyek egyetlen kibocsátó fajt generálnak viszonylag alacsony szintű háttérautofluoreszcenciával rendelkező mintákban.
A sávszűrők csak egy bizonyos hullámhosszú sávot továbbítanak, másokat blokkolnak. Csökkentik az áthallást azáltal, hogy csak a fluorofor emissziós spektrum legerősebb részét engedik át, csökkentik az autofluoreszcens zajt, és így javítják a jel-zaj arányt a magas háttér autofluoreszcens mintákban, amit a hosszú áteresztő szűrők nem tudnak biztosítani.
Hányféle fluoreszcens szűrőkészletet tud a BestScope szállítani?
Néhány elterjedt szűrőtípus a kék, zöld és ultraibolya szűrő. A táblázat szerint.
| Szűrőkészlet | Gerjesztő szűrő | Dichroic Mirror | Barrier szűrő | LED lámpa Hullámhossz | Alkalmazás |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluoreszcens antitest módszer ·Acidin narancs: DNS, RNS ·Auramin: Tubercle bacillus ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamin, TRITC: Fluoreszcens antitest módszer ·Propidium-jodid: DNS ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Auto-fluoreszcencia megfigyelés ·DAPI: DNS-festés · Hoechest 332528, 33342: kromoszómafestéshez használják |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katekolaminok ·5-hidroxi-triptamin ·Tetraciklin: csontváz, fogak |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
A fluoreszcencia felvételéhez használt szűrőkészleteket a fluoreszcencia alkalmazásokban használt fő hullámhosszok köré tervezték, ami a leggyakrabban használt fluoroforokon alapul. Emiatt a képalkotásra szánt fluoroforról is nevezték el őket, például DAPI (kék), FITC (zöld) vagy TRITC (piros) szűrőkockák.
| Szűrőkészlet | Gerjesztő szűrő | Dichroic Mirror | Barrier szűrő | LED lámpa Hullámhossz |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas vörös | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Hogyan válasszunk fluoreszcens szűrőt?
1. A fluoreszcens szűrő kiválasztásának elve az, hogy a fluoreszcencia/emissziós fényt a lehető legmesszebbre engedje át a képalkotás végén, és egyidejűleg teljesen blokkolja a gerjesztő fényt, hogy a legmagasabb jel-zaj arányt érje el. Különösen a többfotonos gerjesztés és a teljes belső reflexiós mikroszkóp alkalmazása esetén a gyenge zaj is nagy interferenciát okoz a képalkotásban, így magasabb a jel-zaj arány követelménye.
2. Ismerje a fluorofor gerjesztési és emissziós spektrumát. Olyan fluoreszcens szűrőkészlet létrehozásához, amely jó minőségű, nagy kontrasztú képet hoz létre fekete háttérrel, a gerjesztési és emissziós szűrőknek magas átvitelt kell elérniük minimális áteresztősáv-hullámozással a fluorofor gerjesztési csúcsoknak vagy emisszióknak megfelelő régiókban.
3. Vegye figyelembe a fluoreszcens szűrők tartósságát. Ezeknek a szűrőknek áthatolhatatlannak kell lenniük az intenzív fényforrásokkal szemben, amelyek ultraibolya (UV) fényt generálnak, ami „kiégéshez” vezethet, különösen a gerjesztő szűrőé, mivel az a fényforrás teljes intenzitásának van kitéve.
A különböző fluoreszkáló mintaképek
A forrásokat az interneten gyűjtik és rendszerezik, és csak tanulásra és kommunikációra használják. Ha bármilyen jogsértést észlel, kérjük, lépjen kapcsolatba velünk a törlés érdekében.
Feladás időpontja: 2022. december 09